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醫療器械體外細胞毒性檢測詳解
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什么是體外細胞毒性試驗？
體外細胞毒性試驗是一種在離體狀態下模擬生物體生長環境，檢測醫療器械及生物材料接觸機體組織后所發生的細胞溶解、抑制細胞生長和其他毒性作用的體外試驗。體外細胞毒性試驗是醫療器械生物學評價體系中最重要的檢測指標之一，幾乎也是醫療器械及生物材料臨床應用前的必選項目。
哪些產品需要進行體外細胞毒性試驗？
與人體接觸或植入體內的醫療器械都需要進行細胞毒性試驗。與人體接觸的部位包括：
1）表面：皮膚，粘膜，損傷表面。
2）外部接入：組織/骨/牙，循環血液。
3）體內植入：組織/骨，血液。
體外細胞毒性試驗的目的和意義
目的：評級醫療器械和生物材料致細胞毒性反應的潛在性，并預測最終生物體應用時的組織細胞反應。通過體外細胞培養技術，可檢測供試品接觸細胞后細胞發生生長抑制、功能改變、細胞溶解、死亡或其他毒性反應。
意義：可在短時間內較經濟、簡便地篩選出批量供試品的細胞毒性，它為動物試驗的進行與否提供了先決條件，對新型醫療器械及生物材料的研制和應用提供了重要保證。
體外細胞毒性試驗依據的相關標準
ISO 10993-5:2009 Biological Evaluation of Medical Devices--Part 5:Tests for in vitro Cytotoxicity
GB/T16886.5-2007醫療器械生物學評價第5部分：體外細胞毒性試驗，GB/T16886是由ISO 10993轉化過來的標準
GB/T 16175-2008醫用有機硅材料生物學評價試驗方法
GB/T 14233.2-2005醫用輸液、輸血、注射器具檢驗方法第2部分：生物試驗方法
YY/T0127.9-2009口腔醫療器械生物學評價第2單元試驗方法細胞毒性試驗：瓊脂擴散法及濾膜擴散法
細胞系和培養基的選擇
優先采用已建立的細胞系并從認可的貯源獲取。試驗只能使用無支原體污染細胞，使用前應該檢測原代培養細胞是否存在支原體。推薦使用小鼠成纖維細胞或人上皮細胞，如果能證明試驗的重現性和精確性，也可選擇其他細胞系。使用凍存細胞時，如果有二甲亞砜或甘油等細胞保護劑，應該除去保護劑，使用前至少傳代培養一次。傳代培養細胞時，采用適合細胞系的酶分散法或機械分散法移出和重懸細胞。
培養基應無菌，含血清或無血清培養基應該符合選定細胞系的生長要求，培養基中可以含有對試驗無不良作用的抗生素，pH值應該保持在7.2~7.4之間，且培養基的貯存條件應該經過驗證才能在此條件下進行保存。
體外細胞毒性試驗原則
體外細胞試驗方法較多，且各有其特點，各試驗方法之間很難達到完全一致，因此在選擇試驗方法時，需根據“最接近應用狀況”的原則，盡可能合理地選擇供試品與細胞的接觸方式和檢測生物終點評價方法。
體外細胞毒性試驗方法
體外細胞毒性試驗具有通用性，可以適用于各種醫療器械和生物材料的評價，GB/T16886.5標準不是規定一個單一的試驗方法，而是規定一個試驗方案，需要在一系列試驗步驟中判斷，以選出最合適的試驗，試驗主要分三類：浸提液試驗，直接接觸試驗和間接接觸試驗（瓊脂擴散試驗和濾膜擴散試驗）。
由于醫療器械產品和材料的多樣性，植入機體環境中的變異性，與機體相互作用的復雜性等因素，選擇哪種方法進行體外細胞毒性評價，不同的試驗人員會有不同的選擇。當一個評價項目具有多個試驗方法時，應考慮試驗的原理、靈敏性、可選性、可定量性、重現性、試驗材料的適用性及局限性等因素進行選擇。例如浸提液法適合檢測溶出物的毒性；直接接觸法對材料的細胞毒性敏感性最高，可檢測出材料微弱的細胞毒性，間接接觸法中的瓊脂擴散試驗適合于毒性大的大批量材料篩選，濾膜擴散法適合于小分子量毒性材料的評價。以上各種方法因原理不同，各有特點，應根據試驗材料本身理化性質、毒性作用強弱及其用途，正確地選擇試驗方法。
浸提液試驗-MTT法，XTT法和WST-8法比較
MTT（二苯基四氮唑）法，又稱MTT比色法，檢測原理是活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯免疫檢測儀在570nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量。在一定細胞數范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比。該方法有靈敏度高、較經濟的優點。
XTT（二甲氧唑黃）是類似MTT的化合物，XTT法檢測原理與MTT法相同。在電子耦合試劑存在的情況下，活細胞線粒體中存在與輔酶Ⅱ相關的脫氫酶，可將黃色的XTT還原成水溶性的橘黃色的甲瓚，生成的甲瓚能夠溶解在組織培養基中，不形成顆粒，可直接用酶標儀測定吸光值。
WST-8（四唑單鈉鹽）屬于MTT的升級產品，檢測原理是在電子耦合試劑存在的情況下，WST-8可以被線粒體內的脫氫酶還原生成高度水溶性的橙黃色的甲瓚產物。產物顏色的深淺與細胞的增殖成正比，與細胞毒性成反比。使用酶標儀在450nm波長處測定OD值，間接反映活細胞數量。該方法簡便、準確、靈敏度高，但是價格比MTT法略高。
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